Метод редактирования генов CRISPR-Cas9 после открытия в 2012 году демонстрирует одно достижение за другим, пишет The Economist.
Разработанный по образцу системы защиты бактерий, который измельчает ДНК агрессивных вирусов, он позволяет легко и точно изменять генетический материал. Этот метод принес революцию в биологических исследованиях и может широко применяться в сельском хозяйстве и медицине.
Но он не идеальный. Первый из его недостатков в том, что лучше всего он замещает гены в клетках, которые делятся, а следовательно, имеют необходимую молекулярную «фурнитуру» для включения только что доставленных фрагментов новой ДНК. Второй — он начинается с разрыва цепей ДНК, чтобы в образовавшиеся в результате промежутки можно было вмонтировать новый генетический материал. Это может иметь нежелательные последствия. Третий — он не очень подходит для корректировки точечных мутаций. Это сбои, которые затрагивают одну-две основы (неформально их еще называют «букв» генома) в последовательности ДНК гена. Собственно, этот недостаток особенно проблематичен, ведь десятки тысяч генетических заболеваний — результат именно таких точечных мутаций.
Впрочем, решение этих проблем, особенно третьей, вполне реальное. Для этого можно изменять конкретные нуклеотиды, не разрезая цепи ДНК, в которые они включены. На прошлой неделе вышла статья, которая описывает приемы, с помощью которых можно это делать: белковые машины под названием «редакторы нуклеотидных основ», которые поддаются программированию, переставляют атомы одной основы так, чтобы она превратилась в конце концов в другую. Еще одна научная статья описывает, как добиться схожего конечного результата — изменения в белке, кодированном геноме, — вообще без непосредственного задействования ДНК.
В начале
Изменение основ было изобретено в прошлом году Дэвидом Лю из Гарвардского университета и его коллегами. ДНК состоит из четырех видов основ, каждая из которых прикреплена к одной или двум молекулярным «хребтам», которые скручиваются в знаменитую двойную спираль молекулы ДНК. Эти основы часто называют А, Ц, Г и Т от первых букв их полных химических названий (аденин, цитозин, гуанин и тимин). Своими формами эти молекулы появились благодаря тому, что Ц на одной цепи двойной спирали всегда спаренный с Г противоположной цепи, а А — с Т. В редакторе основ доктора Лиу используется сочетание CRISPR-Cas9 с энзимом цитидин-деаминаза. В нем также использовалась версия деактивированной Cas9, то есть энзим прикрепляется к ДНК, но уже ее не разрезает. В результате получилась молекулярная конструкция, которой удалось найти конкретные пары оснований Г — Ц в клетке и превратить их в Т — А.
В одной из работ, опубликованных на прошлой неделе в журнале Nature, описывается способ расширения этого метода, с помощью которого можно преобразовывать пары А — Т на Г — Ц. Таким образом можно корректировать больше генетических ошибок. Создать этот второй редактор основ было труднее первого, потому что в природе нет эквивалента цитидин-деаминазы, использованной доктором Лю, а без него механизм не будет работать. Зато создать его взялась Николь Годелли из гарвардской команды Лиу.
Нужный энзим — аденин-деаминаза, который работает с ДНК. Варианты этого энзима есть, но они действуют на РНК — похожей, но не идентичной молекуле. Годелли решила видоизменить вариант для РНК, чтобы применять его на ДНК.
Для начала она взяла очень популярную среди биологов бактерию Escherichia coli. Выбранная ею E. coli имела дефекты в генах, которые отвечают за сопротивляемость к антибиотикам. Важный момент: мутации, которые повлекли за собой дефект в этих генах, можно было бы, собственно, исправить аденин-деаминазой, которая работает в ДНК. Поэтому Годелли создала много различных вариантов РНК-версии этого гена, надеясь, что какой-то из них окажется пригодным для ДНК и проявит себя, спасая бактерии, которые иначе погибли бы от действия антибиотиков.
Она выбрала самые перспективные варианты, подвергла их повторной мутации и повторила этот процесс. В конце концов получила энзим, который можно было прикрепить к CRISPR-Cas9, чтобы выполнить преобразование пар оснований А — Т на Г — Ц. Это сработало. Сочетание инструментов для редактирования основ дает желаемый эффект в более чем половине случаев. Использование только CRISPR-Cas9 для проведения таких точечных мутаций срабатывает только в 4% случаев. Кроме того, CRISPR-Cas9 часто непредсказуемо вставляет или удаляет фрагменты ДНК. Во время редактирования основ этого почти не наблюдается.
Фундамент прогресса
В статье, вышедшей в журнале Science, РНК досталось больше внимания. Одна из важнейших функций РНК в клетке — переносить информацию от генов в ядре до механизмов производства белков в цитоплазме: сигнализировать этим механизмам о том, что именно нужно производить. В статье один из первых разработчиков метода CRISPR-Cas9 Фэн Чжан из Института Брода в Кембридже описывает редактор оснований с применением Cas13 — энзима, что разрезает РНК так, как Cas9 разрезает ДНК, и еще одного энзима, который может нейтрализовать действие мутаций Г в А. Хотя редактор доктора Чжана работает с РНК, а не ДНК, его действие (по крайней мере временно) такая же. Подставляя одну основу вместо другого, он меняет состав, а следовательно, и действие белка.
Если посмотреть на эти разные статьи, становится заметной более масштабная тенденция: инструментарий генной инженерии быстро расширяется. В частности, сейчас опробуют варианты Cas9 с целью совершенствования системы CRISPR-Cas9. Еще один энзим, Cpf1, быстро набирает популярность как заменитель Cas9 для работы с CRISPR.
Ученые, которые разработали редактирование нуклеотидных оснований, замахнулись даже на эпигеном. Это система, по которой некоторые гены выключаются в результате химического процесса под названием метилирование. Это элемент механизма, который определяет, к какому типу клеток принадлежит данная клетка. До недавнего времени епигеномное редактирование казалось делом далекого будущего. Но благодаря скорости появления новых технологий по редактированию генов можно вполне ожидать его и раньше. Сейчас возможности генной инженерии кажутся безграничными.